Phác họa bài post:
⓪
Đề dẫn
①
Chiều dài gen?
②
Độ phức tạp của DNA sequencing
③
Nguyên lý hoạt động của DNA sequencing
④
De novo sequencing vs. resequencing
⑤
Tương lai của DNA sequencing?
⑤++
Nhìn ra ngoài Vũ trụ
Xin phép anh/chị
hôm nay chúng ta đàm luận về DNA sequencing – tạm dịch là “giải trình
tự DNA”.
Tế bào của tất
cả các loài sinh vật trên Trái Đất chứa trong lõi của nó một bộ mã – bộ mã này
chính là DNA. Thế bộ mã này có tác dụng gì? Tế bào “đọc” mã DNA để “sản xuất”
ra protein. Và tập hợp các protein chịu trách nhiệm “điều hành” sự sống. Đấy,
đơn giản là vậy 😊.
~
Để giúp anh/chị
quyết định có đọc tiếp hay không, tôi xin phép cung cấp các thông tin liên quan
đến bài post này như sau:
·
Chủ
đề: Bioinformatics,
DNA (DeoxyriboNucleic Acid)
·
Tính
thời sự: tháng 4/2022
·
Thời
gian đọc: 6 phút, không
tính thời gian uống cà phê
🧬
⓪ Đề dẫn.
Các nhà bác học
đã phát hiện ra mô hình cấu trúc DNA từ năm 1953 (tham
khảo). Theo mô hình này,
DNA được cấu tạo bởi hai chuỗi nucleotide xoắn kép (double-helix),
liên kết với nhau bằng liên kết hydro và chạy ngược chiều nhau. Mỗi sợi được cấu
tạo tổ hợp từ bốn nucleotide cơ sở (base): adenine (A), cytosine
(C), guanine (G) và thymine (T).
-
Dưới góc độ
ngôn ngữ máy tính thì mỗi một sợi được tạo thành từ chuỗi các cơ số (base)
mà mỗi một cơ số được chọn từ tập hợp các mã {A, C, G, T}. Như vậy, một sợi DNA
là một chuỗi các ký tự mà mỗi một ký tự thuộc tập hợp {A, C, G, T}. Điểm đặc biệt
là hai sợi xoắn kép này không độc lập mà bổ sung cho nhau theo cấu trúc redundant
(dư thừa). Nếu trên một sợi có cơ số (base) A thì trên sợi kia tương
ứng sẽ là cơ số (base) T (và ngược lại). Nếu trên một sợi có cơ số (base)
C thì sợi kia tương ứng sẽ là cơ số (base) G (và ngược lại).
A ↔ T
C ↔ G
Các cơ số được
“đọc” theo hai chiều ngược nhau. Trong hình minh họa ở trên, chúng ta viết chuỗi
sợi kép như sau (chúng ta đọc các cơ số từ đầu 5’ đến đầu 3’ – xem hình vẽ minh
họa ở trên):
<----
CGAT
||||
ATCG
---->
-
Để thống nhất về
mặt ngôn từ, trong ví dụ trên, mẫu DNA này có 4 base pair (cặp cơ số) –
viết tắt là bp. Để đơn giản hóa, thường người ta chỉ viết trình tự của một sợi (trình
tự của sợi còn lại được suy ra từ sợi kia).
-
Mô hình cấu
trúc DNA đã được biết - nhưng làm thế nào để biết được trình tự gốc các bp nằm
trong “chuỗi” lại là một câu chuyện khác. Như vậy, vấn đề của DNA sequencing
là xác định được trình tự DNA.
🧬
① Chiều dài gen?
⁇ Cái tiếp theo gây tò mò cho chúng ta là
các loài sinh vật, bộ gen (DNA) của chúng có chiều dài là bao nhiêu, tính theo
bp? (Nguồn)
·
Gen
người: khoảng 3 tỷ bp.
·
Chim:
trên dưới 1 tỷ bp.
·
Vi
khuẩn (bacteria): khoảng 3 triệu bp.
·
Bò
sát: dao động từ 2-4 tỷ bp
·
Động
vật có vú (mammals): 3.5 tỷ bp.
·
Động
vật lưỡng cư (amphibian: ếch, cóc, sa giông và kỳ nhông): 32 tỷ bp (gấp
10 lần gen người!).
·
Loài
hoa paris japonica: 149 tỷ bp (gấp 50 lần gen người!).
·
…
Thế các loài
virus có bao nhiêu bp trong gen (RNA) của chúng? Một vài ví dụ:
·
Sars-cov-2
(virus gây ra đại dịch Covid-19): 29.903 bp (nguồn).
·
Hepatitis
B (virus gây viêm gan B): khoảng 3.200 bp (nguồn).
·
Ebola
(virus gây bệnh Ebola): khoảng 19,000 bp (nguồn).
Như vậy, có thể
thấy là độ dài của DNA biến động từ hàng ngàn đến hàng trăm tỷ bp.
🧬
② Độ phức tạp của DNA sequencing
⁇ Câu hỏi: Giải trình tự DNA có phức tạp không? Để
trả lời câu hỏi này, tốt nhất chúng ta lấy ví dụ từ thực tế: Human Genome
Project – Dự án bản đồ gen người (nguồn):
·
Năm
1990 Quốc hội Mỹ phê duyệt dự án Human Genome Project, dự kiến kinh phí
3 tỷ USD (tính theo tỷ giá năm 1991) trong thời gian 15 năm (1990-2005).
·
Dự
án hoàn thành năm 2003, trước thời hạn 2 năm, với kinh phí là 2.7 tỷ USD. (Nếu
tính cả lạm phát, người ta ước tính là chi phí này tương đương 5 tỷ USD vào năm
2018.)
·
Có
20 tổ chức, cơ sở nghiên cứu tham gia dự án từ các quốc gia là Hoa Kỳ (12), Đức
(3), Nhật (2), Anh (1), Pháp (1), Trung Quốc (1).
·
Tuy
được gọi là hoàn thành vào năm 2003 nhưng vào thời điểm đó người ta mới chỉ giải
được trình tự của 92.1% bộ gen. Các đoạn mã mà người ta chưa giải được trình tự
được gọi là gap (lỗ hổng).
·
Đến
tháng 3/2009 vẫn còn 300 gaps, năm 2015 vẫn còn 160, tháng 5/2020 còn
79, năm 2021 còn 5 và vào tháng 4/2022 thì người ta đã hoàn tất bản đồ gen người.
·
Như
vậy, thời gian thực tế kéo dài đến 32 năm, mặc dù kể từ năm 2003, người ta
không tập trung nhiều nguồn lực như trước.
·
Để
cảm nhận được tầm quan trọng của việc giải mã DNA (giải mã sự sống) mời anh/chị
tham khảo video thông báo của Nhà trắng (ngày 26/6/2000) về bản
thảo Bản đồ gen người với sự tham gia của Bill Clinton (Tổng thống Hoa Kỳ),
Tony Blair (Thủ tướng Anh), nhà khoa học Francis Collins (lúc đó là Giám đốc National
Human Genome Research Institute), Craig Venter (được biết đến là người đầu
tiên đưa ra bản thảo Bản đồ gen người). Người ta xem đây là một bước đột phá của
nhân loại.
Trả lời: Giải trình tự DNA rất phức tạp 😊!
🧬
③ Nguyên lý hoạt động của DNA sequencing
⁇ Thứ tò mò tiếp theo là cách thức hoạt động
của máy giải trình tự DNA (DNA Sequencer)? Chúng ta có thể hình dung một
cách đơn giản rằng khi cho đầu vào là một mẫu DNA thì máy Sequencer sẽ
cho đầu ra là một chuỗi các ký tự tổ hợp từ {A, C, G, T}.
Mẫu DNA → [Sequencer]
→ Trình tự DNA
Trên thực tế,
giải pháp trên có một vấn đề. Vấn đề là mỗi một lần “đọc”, Sequencer thường
chỉ “đọc” được một đoạn ngắn DNA – có độ dài từ 100-1000 bp. Vậy làm thế nào để
giải được trình tự của các bộ gen có chiều dài hàng tỷ bp (như gen người có khoảng
3 tỷ bp)?
💡 Có một ý tưởng giải quyết vấn đề này như sau:
1.
Đầu
tiên, người ta nhân bản DNA thành nhiều bản sao y hệt nhau (tham khảo PCR) và cắt các bản sao này thành từng phân mảnh ngắn (cắt một
cách ngẫu nhiên) có độ dài chỉ khoảng vài trăm bp
2.
Các
phân mảnh ngắn này cho chạy qua máy Sequencer – máy này “đọc” trình tự
DNA của từng phân mảnh, gọi là read
3.
Sau
đó dùng phần mềm để ráp các đoạn đọc được (read) thành chuỗi trình tự gốc
ban đầu.
Một cách cô đọng:
DNA → [phân mảnh]
→ [Sequencer] → [reads] → [ráp các reads] → Trình tự gốc
-
Có thể hình
dung chuỗi DNA như một đoạn văn dài. Việc phân mảnh tương tự như việc ta cắt đoạn
văn dài đó thành nhiều “phân mảnh” (là đoạn văn ngắn) một cách ngẫu nhiên. Các
đoạn văn ngắn không tách rời hoàn toàn mà có phần phủ lên nhau như lợp ngói. Sau
đó, căn cứ vào phần phủ lên nhau của các “phân mảnh” (đoạn văn ngắn) chúng ta
tìm cách ráp để tìm lại đoạn văn bản gốc ban đầu. Để cho dễ hiểu, tôi xin phép
lấy một ví dụ, trích từ tác phẩm “Dế mèn phiêu lưu ký” của nhà
văn Tô Hoài. Chúng ta có các “phân mảnh” (đoạn văn ngắn) sau đây:
· một cái hang đất ở bờ ruộng phía bên kia, chỗ trông ra đầm
nước
·
be
đắp tinh tươm
thành hang, thành nhà cho chúng tôi từ bao giờ.
· đầm nước mà không biết mẹ đã chịu khó đào bới, be
đắp tinh tươm
·
Mẹ
dẫn chúng tôi đi và mẹ đem đặt mỗi đứa vào một cái hang đất
Phần in đậm là
phần phủ lên nhau của các “phân mảnh”. Sau khi ráp các phần phủ lên nhau chúng
ta suy ra được văn bản gốc như sau:
Mẹ dẫn chúng
tôi đi và mẹ đem đặt mỗi đứa vào một cái hang đất ở bờ ruộng phía bên
kia, chỗ trông ra đầm nước mà không biết mẹ đã chịu khó đào bới, be đắp
tinh tươm thành hang, thành nhà cho chúng tôi từ bao giờ.
⚠ Chú ý: trên thực tế, ráp
trình tự (sequence assembly) là vấn đề rất phức tạp - mời anh/chị tham
khảo bài toán “ráp trình tự”.
-
Ý tưởng cắt nhỏ
rồi ráp lại như trên có tên gọi là shotgun sequencing (giải trình tự theo phương pháp súng ngắn)
được Staden đề xuất lần đầu vào năm 1979 (bài báo). Vào thời điểm của bài báo (1979) và
mãi cho đến tận đầu những năm 2000, giới nghiên cứu chỉ biết đến phương pháp giải
trình tự của Sanger (Sanger sequencing). Ngay cả dự án khổng lồ Human
Genome Project (dự án bản đồ gen người), người ta cũng chỉ biết đến phương
pháp của Sanger. Điểm hạn chế cơ bản của phương pháp này là mỗi một lần chạy,
máy chỉ đọc được duy nhất một read với chiều dài không quá 1.000 bp. Vì
vậy, để có thể đọc được nhiều read, cách duy nhất là phải sử dụng nhiều
máy đồng thời, mỗi máy đọc một đoạn DNA khác nhau. Sau đó dùng phần mềm để ráp
các read (xem giải thích ở trên).
Mời anh/chị
tham khảo các con số thực tế của phương pháp Sanger (nguồn):
·
Chiều
dài mỗi read: 400-900 bp
·
Độ
chính xác: 99.9%
·
Số
lượng read/1 lần chạy: 1
·
Thời
gian 1 lần chạy: 20 phút – 3 giờ
·
Đơn
giá để giải trình tự 1 tỷ bp: $2,400,000 (hai triệu bốn trăm nghìn USD)
-
Vì các hạn chế
của phương pháp Sanger, các nhà khoa học bắt buộc phải tìm một giải pháp khác với
mục tiêu là tăng tốc độ xử lý. Vào khoảng năm 2004-2005, người ta đưa ra một
cách tiếp cận mới để giải trình tự DNA có tên là ‘massively parallel’ (xử lý song song quy mô lớn). Dòng
công nghệ này được đặt tên là ‘next-generation’ DNA sequencing (Giải
trình tự DNA 'thế hệ tiếp theo'), viết tắt NGS. Ý tưởng đột phá của NGS là multiplexing
– xử lý đa kênh. Mỗi một lần chạy, phương pháp của Sanger chỉ cho phép 1 phản ứng
(reaction) xảy ra trong ống nghiệm. Trong lúc đó, NGS cho phép hàng trăm
nghìn, hàng triệu phản ứng xảy ra đồng thời. NGS có thể giải trình tự đồng thời
khoảng 500,000 phân mảnh (mỗi phân mảnh có độ dài cỡ hàng trăm bp). Đến thời điểm
hiện nay thì NGS đã tiến rất xa so với công nghệ “cổ điển” (phương pháp của
Sanger). Dòng công nghệ này có khả năng giải trình tự toàn bộ bộ gen người chỉ
trong vòng một ngày! (Nguồn)
Vào năm 2019, các hãng dẫn đầu của dòng NGS gồm Illumina,
Qiagen
và ThermoFisher Scientific, trong đó Illumina chiếm thị phần lớn
nhất.
Mời anh/chị
tham khảo các con số thực tế của dòng máy Illumina (nguồn):
·
Chiều
dài mỗi read:
o
MiniSeq, NextSeq: 75–300 bp;
o
MiSeq: 50–600 bp;
o
HiSeq 2500: 50–500 bp;
o
HiSeq 3/4000: 50–300 bp;
o
HiSeq X: 300 bp
·
Độ
chính xác: 99.9% (tức là phred30 – tham khảo Phred quality score)
·
Số
lượng read/1 lần chạy:
o
MiniSeq/MiSeq: 1-25 triệu;
o
NextSeq: 130-400 triệu;
o
HiSeq 2500: 300 triệu - 2 tỷ;
o
HiSeq 3/4000: 2.5 tỷ;
o
HiSeq X: 3 tỷ
·
Thời
gian 1 lần chạy: 1-11 ngày
·
Đơn
giá để giải trình tự 1 tỷ bp: $5 - $150
-
Đối với phương
pháp cổ điển (phương pháp Sanger) hoặc thế hệ NGS, khi muốn giải trình tự DNA,
chúng ta bắt buộc phải gửi mẫu DNA đến các trung tâm tính toán. Thời gian chờ kết
quả phải tính bằng ngày/tuần/tháng. Có cách nào để giải trình tự trực tiếp từ một
thiết bị cầm tay không? Các nhà khoa học tiếp tục tìm cách giải trình tự DNA
theo cách tiếp cận mới này. Đại diện cho giải trình tự DNA “thế hệ thứ ba” là công
nghệ nanopore. Công nghệ này dựa trên ý tưởng ép sợi
DNA cho đi qua một lỗ nhỏ trên màng, mỗi một base bật ra giống như một hạt
trên một chuỗi. Bằng cách đo sự thay đổi độ dẫn điện khi mỗi base khác
nhau di chuyển qua lỗ, từ đó có thể đọc một cách trực tiếp trình tự của sợi DNA.
Công nghệ này có thể đọc được các đoạn DNA rất dài lên tới 2,272,580 bp (nguồn).
Mời anh/chị
tham khảo các con số thực tế của phương pháp giải trình tự nanopore (nguồn):
·
Chiều
dài mỗi read: người dùng có thể cài đặt con số này – cao nhất 2,272,580
bp
·
Độ
chính xác: ~92–97%
·
Số
lượng read/1 lần chạy: căn cứ theo cài đặt của người dùng
·
Thời
gian 1 lần chạy: 1 phút – 48 giờ
·
Đơn
giá để giải trình tự 1 tỷ bp: $7 - $100
🧬
④ De novo sequencing vs. resequencing
De novo dịch từ tiếng Latin có nghĩa là "từ
đầu". Khi giải trình tự gen của một loài nào đấy, việc giải trình tự của
cá thể đầu tiên trong loài đó được gọi là De novo sequencing – giải
trình tự khởi phát từ đầu. Nghĩa là việc giải trình tự không dựa được vào một
khung mẫu có sẵn nào cả.
Bây giờ, giả
thiết rằng chúng ta đã giải trình tự được một cá thể đầu tiên của một loài (ví
dụ đã giải được trình tự DNA của người đầu tiên trong dự án bản đồ gen người).
Cá thể tiếp theo cùng loài, rõ ràng là phải có rất nhiều đoạn DNA có
trình tự giống với cá thể đầu tiên. Người ta lấy trình tự đã giải được của
cá thể đầu tiên làm khung mẫu cho việc giải trình tự các cá thể khác cùng
loài. Việc giải trình tự các cá thể khác này được gọi là resequencing.
Lấy ví dụ về dự
án HGP (dự án bản đồ gen người). Người đầu tiên cho mẫu DNA là một cá nhân từ
thành phố Buffalo, bang New York, Hoa Kỳ có nguồn gốc nửa châu Âu, nửa châu Phi
(nguồn). Người đầu tiên resequence bộ gen của mình là Craig Venter
vào năm 2007, người tiếp theo là James Watson.
(Vào năm 1953, James Watson là đồng tác giả của bài báo khoa học cùng với Francis Crick
đề xuất cấu trúc chuỗi xoắn kép của phân tử DNA.)
Cũng xin lưu ý
với anh/chị: DNA sequencing là một quá trình tiệm cận. Vì sao vậy? Tất cả
các loại thiết bị, quy trình thí nghiệm, phần mềm chưa bao giờ đạt được độ
chính xác 100% cả. Lấy ví dụ về các con số thực tế tôi đã trích dẫn ở trên, độ
chính xác thuộc loại cao là 99.9%. Với độ chính xác này, khi giải trình tự gen
người thì sai số là bao nhiêu bp? Chúng ta dễ dàng tính ra ngay: gen người có khoảng
hơn 3 tỷ bp, độ chính xác là 99.9% tương đương với sai số 0.1% = 1/1.000, lấy 3
tỷ nhân với 0.1%: 3.000.000.000 /1.000 = 3.000.000 (ba triệu) bp! Sai số là 3
triệu bp – một sai số đáng kinh ngạc, đúng không ạ!
Sau khi có nhiều
cá thể resequencing thì bản đồ gen dần hiện hình rõ nét. Bản đồ gen gồm
các đoạn DNA chung cho tất cả các cá thể cùng loài và các đoạn DNA riêng cho từng
cá thể. Việc này giống như việc chúng ta vẽ một bức tranh. Nếu chỉ có vài nét
thì rất khó hình dung. Càng có nhiều nét vẽ thì bức tranh càng rõ. Số lượng
“nhiều nét” của bản đồ gen người phải đạt con số hàng triệu, hàng chục triệu
trên ước tính dân số hiện nay của thế giới là khoảng 8 tỷ người.
🧬
⑤ Tương lai của DNA sequencing?
Ngoài loài người
ra, trên Trái Đất có bao nhiêu loài sinh vật? Thưa anh/chị tôi có Google và được
đáp án khoảng một nghìn tỷ loài (1.000.000.000.000)! Đó là chưa tính các loài
đã bị tuyệt chủng. Chú ý rằng hoàn toàn có thể giải trình tự DNA các loài đã bị
tuyệt chủng. Xem ra, công việc của các nhà khoa học còn khá nhiều 😊.
Tất nhiên, các
nhà khoa học sẽ lấy cái hữu hạn để tiếp cận cái vô hạn. Ví dụ, họ
sẽ biến các máy DNA sequencing như là một thiết bị cảm biến (sensor),
có thể hiển thị chuỗi DNA trong giây lát, lập phân tích (analysis) và
báo cáo tức thì (real-time) lên một App trên thiết bị di động (như
chiếc smartphone mà anh/chị đang sở hữu). Tất nhiên, đó là tôi nói về một
giả định trong “thì tương lai”. Còn với “thì hiện tại” DNA sequencing được
đánh giá chỉ đang ở trong giai đoạn sơ khai.
🧬
⑤++ Nhìn ra ngoài Vũ trụ
Trước khi kết
thúc bài post này, tôi xin phép cung cấp anh/chị một thông tin – đó là bài báo
với tựa đề “Identifying the wide diversity of
extraterrestrial purine and pyrimidine nucleobases in carbonaceous meteorites” đăng trên ‘Nature Communications’
vào ngày 26/4/2022. Đại ý là sau khi phân tích một nhóm thiên thạch, lần đầu
tiên các nhà khoa học Nhật Bản tìm thấy năm thành phần cơ bản của DNA trong các
thiên thạch này. Nghiên cứu này củng cố giả thuyết rằng nguồn gốc của sự sống
trên Trái Đất đến từ không gian ngoài vũ trụ! Vì vậy, việc đọc được mã DNA
không những giúp khám phá các bí ẩn của sự sống trên Trái Đất mà có thể giải mã
được sự sống (nếu có) trong vũ trụ bao la 😊.
-
Chúc anh/chị đọc
vui nhã!
(\_/)
(
•_•)
/
>☕
